植物生產與環境農業生物技術

發酵工程這項技術主要包括菌種選育、菌種生產、代謝產物的發酵以及微生物功能的利用等技術。 7．生物藥物製品包括生物體的初級和次級代謝產物，或生物體的某一組成部分，甚至整個生物體，主要有蛋白質、核酸、糖類、脂類等。 10．自從1982年第一個基因重組產品人胰島素上市以來，美國已批准近100個生物技術藥品上市，我國也有近50種產品上市。 12．1982年第一個生物技術藥物——利用細菌生產的人胰島素獲得FDA批准並投放市場，它標誌着現代生物技術醫藥產業的興起。 第二章 基因工程製藥 2．1989年，第一個基因工程藥物干擾素批准上市；1992年，第一個基因工程乙肝疫苗投入市場。 6．在瓊脂糖凝膠電泳中不同構型的同一質粒DNA雖有相同的相對分子質量(Mr)，卻具有不同的遷移率，遷移速率大小爲cccDNA>1DNA>ocDNA。 7．質粒具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力；質粒具有不相容性。 10．最常見的選擇標記爲抗生素抗性基因，包括氨苄西林(Amp)、四環素(Tet)、氯黴素(Cm)，卡那黴素(Kan)和新黴素(Neo)等。 21．目前將重組DNA導入酵母的方法包括電轉化法、化學轉化法、原生質體轉化法。 28．目前常用的融合蛋白表達體系有谷胱甘肽S-轉移酶(GST)表達體系、金黃色葡萄球菌蛋白A表達體系、麥芽糖結合蛋白MBP表達體系等。 32．酵母表達系統包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等表達系統。 34．宿主菌不同、整合方式不同可獲得三種營養表型：甲醇利用正表型(Mut+)、甲醇利用慢表型(Muts)和甲醇利用負表型(Mut_)。 35．巴斯德畢赤酵母適宜的表達溫度爲300℃。 44．因此反滲透、超濾和微濾的相同點都是以壓力差爲驅動力；不同點是：反滲透只允許溶劑通過，可濃縮溶質或製備純水；超濾可根據Mr的人小實現大分子物質的篩分，並可同時實現截留分子的濃縮：微濾只截留不溶性的顆粒。 46．包涵體形式表達對蛋白質分離純化有兩方面的影響：積極的方面是比較容易與胞內可溶性蛋白雜質分離，使純化較容易完成：消極的方面是包涵體需要經過復性才能擁有生物學活性。 5l．人血清白蛋白是人血漿中含量最高的蛋白質(40g／L)，由585個氨基酸殘基組成，Mr爲65kD。HSA具有維持血液滲透壓、運輸營養物質以及其他重要生物物質的作用。同時，HSA又是許多內源因子和外源藥物的載體，藥物和HSA結合以後，可以降低其生物利用度，並延長藥物在體內的半衰期。 54．人血清白蛋白融合的重組蛋白類藥物使蛋白類藥物克服了半衰期短、清除率高的缺點，在保持原有藥物活性的基礎上，延長了蛋白質類藥物的半衰期、降低了體內清除率，實現蛋白質類藥物的長效治療。 55．基因工程藥物質量控制項目主要有：蛋白質含量測定、純度分析、蛋白性質測定、生物學效價測定、雜質分析等。 56．蛋白質純度檢測基因工程藥物純度檢測的方法主要有：①SDS—PAGE法；②非變性PAGE法；③層析法等。 57．Mr測定方法主要有：①SDS-PAGE法；②層析法；③質譜法等。SDS-PAGE、層析法都只能粗略地測定蛋白質的Mr，而質譜法能夠精確測定蛋白質的Mr。 58．蛋白質等電點測定一般採用等電聚焦凝膠電泳。 64．目前鑑定蛋白質純度的方法常見的有電泳法、層析法、質譜法和末端氨基酸殘基分析法等。 66．實驗室常用的蛋白質Mr的測定方法是SDS-PAGE法，它是在SDS存在下，蛋白質表面帶有大量負電荷，在這種情況下電泳，蛋白質移動的速度只與Mr大小有關，而與蛋白質本身的電荷無關。目前最爲常用、最爲準確的測定蛋白質Mr的方法是質譜法。 83．目前重組人胰島素的生產中應用的主要有兩種宿主表達系統：大腸桿菌表達系統和酵母表達系統。 91．hGH普遍存在於各種組織內，尤其是肝臟組織，是一個多靶點的重要生物分子。其分泌受生K激素釋放激素(GHRH)和生長激素抑制素的調控，呈脈衝式釋放。 92．臨牀上hGH主要用於治療由於腦垂體生長素分泌不足而導致的垂體性侏儒症，除此之外還可用於燒傷、骨折、創傷、出血性潰瘍、組織壞死、肌肉萎縮及骨質疏鬆等疾病的輔助治療。 93．hGH是由191個氨基酸殘基組成的單鏈球形酸性蛋白，等電點爲5．2，Mr約爲21．7kD，在55～165和182～189氨基酸殘基之間具有兩對鏈內二硫鍵，不含糖基，其在體內10％以變異體形式存在(Mr爲20kD)，缺失32～46這—段氨基酸殘基序列。 第三章 動物細胞工程製藥 2．1957年，Dulbecco實驗室採用胰蛋白酶消化處理，使成塊的組織分散成單個細胞，並用液體培養的方法獲得了單層細胞，從而開創了真正意義上的動物細胞培養技術。 6．根據體外培養時動物細胞對生長基質的依賴性，可將動物細胞分爲貼壁依賴性細胞、非貼壁依賴性細胞和兼性貼壁細胞三種類型。 9．細胞深低溫保存的基本原理是：在_70℃以下時，細胞內的酶活性均已停止，即代謝處於完全停止狀態，故可以長期保存。 10．細胞低溫保存的關鍵在於通過0～20℃階段的處理過程。 11．細胞復甦的原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。 15．合成培養基的化學成分主要爲氨基酸、碳水化合物、蛋白質、核酸類物質、維生素、輔酶、激素、生長因子、微量元素及緩衝劑等。 17．人們經過研究發現，只要在培養基中增加某些適於細胞生長的成分，如纖連蛋白、轉鐵蛋白、胰島素、表皮生長因子等。 22．常用消化液有胰蛋白酶溶液、EDTA溶液。 23．EDTA爲一種化學整合劑，其溶液又稱Versen液，對細胞具一定的非酶性解離作用。 27．一般lg組織中約有109個細胞。 29．二倍體細胞系一般從動物胚胎組織中獲取，有明顯的貼壁和接觸抑制特性，有正常細胞的核型，一般可傳代培養50代，且無致瘤性。 32．基因工程細胞系的構建大致包括表達載體的構建、表達載體的導入以及表達細胞株的篩選等過程。 41．一般來說，融合細胞的構建主要包括細胞融合和細胞篩選兩個過程。 56．人EPO有2個等位基因。 62．利用動物細胞培養製造促紅細胞生成素的工藝條件有攪拌速度、溫度、pH值、氧、葡萄糖等。 第四章 抗體工程製藥 2．多抗的優勢是：作用全面，具有中和抗原、免疫調理、激活補體系統、抗體依賴細胞介導的細胞毒(ADCC)等重要作用，來源廣泛，製備容易。 4．多抗被用於預防或治療感染性疾病，例如乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、鉅細胞病毒和狂犬病毒引起的感染，還用於破傷風桿菌、肉毒毒素中毒的治療。 6．單抗改造的主要目的是降低或去除鼠抗體的成分，用人抗體的相應成分取代。 13．單抗的製備過程大體分爲抗原的製備、動物的免疫、B細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞、篩選雜交瘤細胞、篩選能產生某種特異性單抗的雜交瘤細胞、雜交瘤細胞的克隆化、體外大規模培養或動物腹腔培養特異性雜交瘤細胞克隆、單抗的純化及鑑定。 16．免疫接種是單抗製備過程中的重要環節之一，其目的在於使B細胞在特異抗原刺激下分化、增殖、分泌特異性抗體。 22．抗原的乳化程度對免疫效果有較大的影響，常用的檢測方法是將形成的油包水乳濁液。 23．體內免疫採用皮下注射、腹腔或靜脈注射，也可採用足墊、皮內、滴鼻或點眼等。 28．免疫脾細胞指的是處於免疫狀態脾臟中的B淋巴母細胞。 35．細胞融合的操作方法很多，常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例爲1︰1～10︰1不等，一般3︰1～5︰1最爲常用。 39．細胞凍存液：50％小牛血清，40％不完全培養液和10％DMSO(二甲亞碸)。 49．Fab抗體片段由重鏈V區及CHI功能區與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發揮抗體的抗原結合功能。 50．FV抗體片段是由一個VH利一個VL組成的。VH利VL通過非共價鍵結合組成，是抗體中具有完整抗原結合活性的最小功能片段，分子量只有完整抗體的l／6。 52．ScFv的製備常採用基因工程技術，主要步驟包括ScFv的基因構建和重組ScFv的表達。 54．製備ScFv的關鍵是得到可變區基因，引物的設計非常重要，因此可以根據FR—l和FR-4的鹼基組成和順序分別合成用於擴增VH和VL基因的PCR引物。 68. CDR是構成抗原抗體結合的最小結構單位。 70．細胞內抗體的主要應用爲：①分子功能的研究；②下調細胞因子受體的表達；③抑制細胞內癌蛋白的活性；④抑制病毒複製。 73．噬菌體抗體庫的篩選包括兩個主要步驟：淘篩和鑑定。 75．全球有7種治療性全人單克隆抗體獲得了美國FDA和歐盟的批准，其中美國FDA批准6種。美國FDA批准的第一種人單抗爲阿達木單抗(2002年)，第二種爲帕尼單抗(2006年)，另4種於2009年批准。這些全人抗體幾乎完全由轉基因小鼠產生(美國FDA批准的6種全人單抗中的5種)，其中1種由轉基因小鼠XenoMouse技術生產，4種由轉基因鼠UltiMab平臺製備。 76．1986年，美國FDA批准上市了第一個用於治療移植物抗宿主病的抗體藥物OrthocloneOKT3，翻開了生物醫藥史上嶄新的一頁。 第五章 疫苗及其製備技術 3．三次疫苗革命是：減毒活疫苗技術——第一次疫苗革命：基因更組疫苗技術——二次疫苗革命；反向疫苗學技術——第三次疫苗革命。 8．疫苗的組成是具有免疫保護性的抗原如蛋白質、多肽、多糖或核酸等與免疫佐劑混合製備而成。 9．前用於人體的佐劑只有兩種：(1)鋁佐劑(氫氧化鋁或磷酸鋁)，是1997年之前唯一可用於人體免疫接種的佐劑；(2)MF59，是1997年由意大利首先批准上市，2005年又由美國FDA批准上市的第二個用於人體的佐劑。 12．減毒活疫苗分爲細菌性活疫苗和病毒性活疫苗兩大類，常用活疫苗有天花疫苗、狂犬病疫苗、卡介苗、黃熱病疫苗、脊髓灰質炎疫苗、腺病毒疫苗、傷寒疫苗、水痘疫苗、輪狀病毒疫苗等。 17．由於DNA疫苗不需要任何化學載體，故又稱爲裸DNA疫苗。 21．理想的效力試驗應具備以下條件：試驗方法與人體使用大體相似；所用試驗動物標準化；試驗方法簡單易行，重複性好；結果明確，能與流行病學調查結果基本一致。 23．活疫苗的效力測定又包括了活菌苗測定和活病毒滴定測定。 25．經典的血清學試驗包括凝集反應、沉澱反應、中和反應和補體結合反應。 第六章 酶工程製藥 4．酶和其他蛋白質一樣，主要由氨基酸組成，具有一、二、三和四級結構。 5．根據酶的組成成分可分爲單純酶和結合酶兩類。 6．酶與一般蛋白質的差別是：酶是具有特殊催化功能的蛋白質。 14．固定化具有延長酶的半衰期、提高酶的穩定性以及可以重複使用等優點。 18．固定化細胞與固定化酶的製備原理有相似之處，也包括吸附法、包埋法、交聯法。此外，還可以採用一些特殊的方法，如細胞絮凝法。 22．聚苯乙烯是世界上第一個用來擔當固定化酶載體材料的合成有機高分子，它主要是通過吸附作用來固定化酶。 27．偶聯率爲1時，表示反應控制好，固定化或擴散限制引起的酶失活不明顯：偶聯率<1時，擴散限制對酶活力有影響；偶聯率>1時，有細胞分裂或從載體排除抑制劑等原因。測定方法可以分爲間歇測定和連續測定兩種。 28．根據生物傳感器中生物識別物質的種類可將生物傳感器分爲酶傳感器、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器等，其中酶傳感器是問世最早、最成熟的生物傳感器。 35．影響酶反應器性能的因素很多，一般可以從以下幾個方面考慮：固定化酶的形狀，底物的物理性質，酶的穩定性及酶反應動力學特性等。 39．造成固定化酶活性的損失可能有下列原因：(1)酶本身的失活：(2)酶從載體上脫落；(3)載體的破碎或溶解。 42．突變酶的應用：提高酶活性及穩定性；研究酶的功能基團。 48．交聯酶晶體的生成通常分爲兩步：(1)酶晶體的形成；(2)使用雙或多功能基團試劑如戊二醛將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內不同肽鏈部分，進行共價交聯，保持酶的活性、酶晶格不被破壞。 58．氨基酰化酶是世界上第一種工業化生產的固定化酶。氨基酰化酶的立體特異性是L-型，可對化學合成的乙酰-DL-氨基酸拆分，從而得到純L-氨基酸。 第七章 發酵工程製藥 3．生物催化劑通常是細菌、放線菌、真菌或其解體產物(如酶)和動植物細胞等。 6．我國酶製劑主要是α-澱粉酶、蛋白酶、糖化酶等。 8．抗生素是最大一類由發酵生產的微生物次級代謝產物，具有廣泛的抗菌作用和抗癌、抗病毒、抗蟲等生物活性，已成爲發酵工業的最重要組成部分。 19．絕大多數放線菌都是革蘭陽性菌，除少數外，它們都是好氧的，生長的最適溫度是28～30℃，當然嗜熱放線菌例外。 30．發酵對無菌空氣的要求是：無菌、無灰塵、無雜質、無水、無油、正壓等幾項指標。 34．在藥物發酵生產中常用的碳源有糖類、脂肪、某些有機酸、醇或碳氫化合物等。 43．上游工程包括優良菌種的選育、最適發酵條件(培養基的組成、pH、溫度和溶氧等)的優化等。 45．下游工程是指發酵液中產品的分離純化與鑑定，副產物的回收，廢物處理等。 48．每批發酵的全過程包括空罐滅菌、培養基的滅菌、接種、發酵、放罐和洗罐等，所用的時間總和爲一個發酵週期。 53．發酵液中產物的積累通常以發酵單位表示。 59．乳糖是青黴素合成的最好碳源。 63．補料最大的量爲使放罐時發酵液體積達到罐有效體積的80％~90％。 89．青黴素屬β-內酰胺類抗生素，其主要作用機制是干擾細菌細胞壁的合成。 93．多糖類一般不溶於水，無甜味，不能形成結晶，無還原性和變旋現象。 第八章 微生物轉化 11．甾體微生物轉化反應主要類型有羥化反應、氧化反應、脫氫反應、甾體邊鏈降解等。 第九章 蛋白質藥物的化學修飾 1．1990年第一個化學修飾蛋白質藥物——PEG修飾的腺苷脫氨酶(PEG-ADA)上市。 4．從大的方面講，修飾策略分爲隨機修飾和定點修飾兩種。 10．G修飾後蛋白質的生物活性、免疫原性、穩定性和生物半衰期與PEG．的Mr大小和修飾類型有關。一般PEG的Mr越大，修飾蛋白的活性損失越大、免疫原性越低、穩定性越高、生物半衰期越長，因此Mr選擇要綜合考慮修飾蛋白的生物活性、免疫原性、穩定性和生物半衰期等多方面的因素。 13． 選擇PEG修飾劑要考慮的因素有PEG的Mr、修飾位點、水解穩定性和反應活性、還需要考慮需要的修飾度、修飾劑與蛋白質的連接鍵的穩定性、修飾後蛋白質的構象變化及修飾後的分離純化等。 第十章 新型生物技術製藥 6．反義核酸藥物福米韋生經過美國FDA批