联用分析技术在农业领域的应用

DNA甲基化检测 在人类基因组中，3%～6%的胞嘧啶都会在DNA甲基化转移酶的作用下与甲基基团结合并在CpG二苷酸的5位碳上形成共价键。CpG二苷酸在人类基因组中常以大小为300～3000bp的密集形式存在（CpG岛），而这些CpG岛通常位于基因的转录起始位置附近，具有调控基因表达的功能。CpG岛的异常甲基化水平升高会抑制相关基因的表达，造成该基因所代表的蛋白质水平急剧下降。 近年来，DNA甲基化在肿瘤研究领域受到了极大关注，特别是CpG岛高甲基化所导致的抑癌基因转录失活及异常低甲基化所致原癌基因的激活已成为肿瘤研究中的热点问题，除此之外DNA甲基化还与印记缺陷、精神分裂症、抑郁狂躁型忧郁症等复杂疾病有一定相关性。 目前常见的甲基化检测方法主要有测序、甲基化特异性PCR、荧光定量PCR等。相比之下，质谱DNA甲基化检测，在引物设计、检测成本及数据分析等方面更加便捷、快速和准确。 其主要检测步骤可分为4个部分： 第一步是通过亚硫酸氢盐反应对基因组DNA进行处理，目的是将序列中未甲基化的C转化为U，而甲基化的C保持不变。 第二步是利用5'末端带有T7启动子序列的引物对目标CpG岛区域进行PCR扩增，并在扩增后加入虾碱性磷酸酶处理残余dNTP。 随后，利用RNA转录酶对扩增产物进行转录并在第四步对转录产物进行尿嘧啶特异性酶切处理。 上述步骤完成后，样品中未甲基化的C最终变为A，而甲基化的C最终变为G，然后质谱可根据G和A之间16Da的分子量差异检测出甲基化和未甲基化的C并通过各自的峰面积计算该CpG位点甲基化比例，并估算整个检测片段内的平均甲基化水平。 质谱平台灵敏度高，可检测低至5%的甲基化水平，特异性良好。