植物生产与环境农业生物技术

发酵工程这项技术主要包括菌种选育、菌种生产、代谢产物的发酵以及微生物功能的利用等技术。 7．生物药物制品包括生物体的初级和次级代谢产物，或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体，主要有蛋白质、核酸、糖类、脂类等。 10．自从1982年第一个基因重组产品人胰岛素上市以来，美国已批准近100个生物技术药品上市，我国也有近50种产品上市。 12．1982年第一个生物技术药物——利用细菌生产的人胰岛素获得FDA批准并投放市场，它标志着现代生物技术医药产业的兴起。 第二章 基因工程制药 2．1989年，第一个基因工程药物干扰素批准上市；1992年，第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。 6．在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一质粒DNA虽有相同的相对分子质量(Mr)，却具有不同的迁移率，迁移速率大小为cccDNA>1DNA>ocDNA。 7．质粒具有遗传传递和遗传交换的能力；质粒具有不相容性。 10．最常见的选择标记为抗生素抗性基因，包括氨苄西林(Amp)、四环素(Tet)、氯霉素(Cm)，卡那霉素(Kan)和新霉素(Neo)等。 21．目前将重组DNA导入酵母的方法包括电转化法、化学转化法、原生质体转化法。 28．目前常用的融合蛋白表达体系有谷胱甘肽S-转移酶(GST)表达体系、金黄色葡萄球菌蛋白A表达体系、麦芽糖结合蛋白MBP表达体系等。 32．酵母表达系统包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系统。 34．宿主菌不同、整合方式不同可获得三种营养表型：甲醇利用正表型(Mut+)、甲醇利用慢表型(Muts)和甲醇利用负表型(Mut_)。 35．巴斯德毕赤酵母适宜的表达温度为300℃。 44．因此反渗透、超滤和微滤的相同点都是以压力差为驱动力；不同点是：反渗透只允许溶剂通过，可浓缩溶质或制备纯水；超滤可根据Mr的人小实现大分子物质的筛分，并可同时实现截留分子的浓缩：微滤只截留不溶性的颗粒。 46．包涵体形式表达对蛋白质分离纯化有两方面的影响：积极的方面是比较容易与胞内可溶性蛋白杂质分离，使纯化较容易完成：消极的方面是包涵体需要经过复性才能拥有生物学活性。 5l．人血清白蛋白是人血浆中含量最高的蛋白质(40g／L)，由585个氨基酸残基组成，Mr为65kD。HSA具有维持血液渗透压、运输营养物质以及其他重要生物物质的作用。同时，HSA又是许多内源因子和外源药物的载体，药物和HSA结合以后，可以降低其生物利用度，并延长药物在体内的半衰期。 54．人血清白蛋白融合的重组蛋白类药物使蛋白类药物克服了半衰期短、清除率高的缺点，在保持原有药物活性的基础上，延长了蛋白质类药物的半衰期、降低了体内清除率，实现蛋白质类药物的长效治疗。 55．基因工程药物质量控制项目主要有：蛋白质含量测定、纯度分析、蛋白性质测定、生物学效价测定、杂质分析等。 56．蛋白质纯度检测基因工程药物纯度检测的方法主要有：①SDS—PAGE法；②非变性PAGE法；③层析法等。 57．Mr测定方法主要有：①SDS-PAGE法；②层析法；③质谱法等。SDS-PAGE、层析法都只能粗略地测定蛋白质的Mr，而质谱法能够精确测定蛋白质的Mr。 58．蛋白质等电点测定一般采用等电聚焦凝胶电泳。 64．目前鉴定蛋白质纯度的方法常见的有电泳法、层析法、质谱法和末端氨基酸残基分析法等。 66．实验室常用的蛋白质Mr的测定方法是SDS-PAGE法，它是在SDS存在下，蛋白质表面带有大量负电荷，在这种情况下电泳，蛋白质移动的速度只与Mr大小有关，而与蛋白质本身的电荷无关。目前最为常用、最为准确的测定蛋白质Mr的方法是质谱法。 83．目前重组人胰岛素的生产中应用的主要有两种宿主表达系统：大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。 91．hGH普遍存在于各种组织内，尤其是肝脏组织，是一个多靶点的重要生物分子。其分泌受生K激素释放激素(GHRH)和生长激素抑制素的调控，呈脉冲式释放。 92．临床上hGH主要用于治疗由于脑垂体生长素分泌不足而导致的垂体性侏儒症，除此之外还可用于烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩及骨质疏松等疾病的辅助治疗。 93．hGH是由191个氨基酸残基组成的单链球形酸性蛋白，等电点为5．2，Mr约为21．7kD，在55～165和182～189氨基酸残基之间具有两对链内二硫键，不含糖基，其在体内10％以变异体形式存在(Mr为20kD)，缺失32～46这—段氨基酸残基序列。 第三章 动物细胞工程制药 2．1957年，Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，并用液体培养的方法获得了单层细胞，从而开创了真正意义上的动物细胞培养技术。 6．根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性，可将动物细胞分为贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞三种类型。 9．细胞深低温保存的基本原理是：在_70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 10．细胞低温保存的关键在于通过0～20℃阶段的处理过程。 11．细胞复苏的原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 15．合成培养基的化学成分主要为氨基酸、碳水化合物、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素及缓冲剂等。 17．人们经过研究发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子等。 22．常用消化液有胰蛋白酶溶液、EDTA溶液。 23．EDTA为一种化学整合剂，其溶液又称Versen液，对细胞具一定的非酶性解离作用。 27．一般lg组织中约有109个细胞。 29．二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养50代，且无致瘤性。 32．基因工程细胞系的构建大致包括表达载体的构建、表达载体的导入以及表达细胞株的筛选等过程。 41．一般来说，融合细胞的构建主要包括细胞融合和细胞筛选两个过程。 56．人EPO有2个等位基因。 62．利用动物细胞培养制造促红细胞生成素的工艺条件有搅拌速度、温度、pH值、氧、葡萄糖等。 第四章 抗体工程制药 2．多抗的优势是：作用全面，具有中和抗原、免疫调理、激活补体系统、抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)等重要作用，来源广泛，制备容易。 4．多抗被用于预防或治疗感染性疾病，例如乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒和狂犬病毒引起的感染，还用于破伤风杆菌、肉毒毒素中毒的治疗。 6．单抗改造的主要目的是降低或去除鼠抗体的成分，用人抗体的相应成分取代。 13．单抗的制备过程大体分为抗原的制备、动物的免疫、B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、筛选能产生某种特异性单抗的杂交瘤细胞、杂交瘤细胞的克隆化、体外大规模培养或动物腹腔培养特异性杂交瘤细胞克隆、单抗的纯化及鉴定。 16．免疫接种是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B细胞在特异抗原刺激下分化、增殖、分泌特异性抗体。 22．抗原的乳化程度对免疫效果有较大的影响，常用的检测方法是将形成的油包水乳浊液。 23．体内免疫采用皮下注射、腹腔或静脉注射，也可采用足垫、皮内、滴鼻或点眼等。 28．免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞。 35．细胞融合的操作方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1︰1～10︰1不等，一般3︰1～5︰1最为常用。 39．细胞冻存液：50％小牛血清，40％不完全培养液和10％DMSO(二甲亚砜)。 49．Fab抗体片段由重链V区及CHI功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。 50．FV抗体片段是由一个VH利一个VL组成的。VH利VL通过非共价键结合组成，是抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段，分子量只有完整抗体的l／6。 52．ScFv的制备常采用基因工程技术，主要步骤包括ScFv的基因构建和重组ScFv的表达。 54．制备ScFv的关键是得到可变区基因，引物的设计非常重要，因此可以根据FR—l和FR-4的碱基组成和顺序分别合成用于扩增VH和VL基因的PCR引物。 68. CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。 70．细胞内抗体的主要应用为：①分子功能的研究；②下调细胞因子受体的表达；③抑制细胞内癌蛋白的活性；④抑制病毒复制。 73．噬菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤：淘筛和鉴定。 75．全球有7种治疗性全人单克隆抗体获得了美国FDA和欧盟的批准，其中美国FDA批准6种。美国FDA批准的第一种人单抗为阿达木单抗(2002年)，第二种为帕尼单抗(2006年)，另4种于2009年批准。这些全人抗体几乎完全由转基因小鼠产生(美国FDA批准的6种全人单抗中的5种)，其中1种由转基因小鼠XenoMouse技术生产，4种由转基因鼠UltiMab平台制备。 76．1986年，美国FDA批准上市了第一个用于治疗移植物抗宿主病的抗体药物OrthocloneOKT3，翻开了生物医药史上崭新的一页。 第五章 疫苗及其制备技术 3．三次疫苗革命是：减毒活疫苗技术——第一次疫苗革命：基因更组疫苗技术——二次疫苗革命；反向疫苗学技术——第三次疫苗革命。 8．疫苗的组成是具有免疫保护性的抗原如蛋白质、多肽、多糖或核酸等与免疫佐剂混合制备而成。 9．前用于人体的佐剂只有两种：(1)铝佐剂(氢氧化铝或磷酸铝)，是1997年之前唯一可用于人体免疫接种的佐剂；(2)MF59，是1997年由意大利首先批准上市，2005年又由美国FDA批准上市的第二个用于人体的佐剂。 12．减毒活疫苗分为细菌性活疫苗和病毒性活疫苗两大类，常用活疫苗有天花疫苗、狂犬病疫苗、卡介苗、黄热病疫苗、脊髓灰质炎疫苗、腺病毒疫苗、伤寒疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗等。 17．由于DNA疫苗不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗。 21．理想的效力试验应具备以下条件：试验方法与人体使用大体相似；所用试验动物标准化；试验方法简单易行，重复性好；结果明确，能与流行病学调查结果基本一致。 23．活疫苗的效力测定又包括了活菌苗测定和活病毒滴定测定。 25．经典的血清学试验包括凝集反应、沉淀反应、中和反应和补体结合反应。 第六章 酶工程制药 4．酶和其他蛋白质一样，主要由氨基酸组成，具有一、二、三和四级结构。 5．根据酶的组成成分可分为单纯酶和结合酶两类。 6．酶与一般蛋白质的差别是：酶是具有特殊催化功能的蛋白质。 14．固定化具有延长酶的半衰期、提高酶的稳定性以及可以重复使用等优点。 18．固定化细胞与固定化酶的制备原理有相似之处，也包括吸附法、包埋法、交联法。此外，还可以采用一些特殊的方法，如细胞絮凝法。 22．聚苯乙烯是世界上第一个用来担当固定化酶载体材料的合成有机高分子，它主要是通过吸附作用来固定化酶。 27．偶联率为1时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显：偶联率<1时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率>1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。测定方法可以分为间歇测定和连续测定两种。 28．根据生物传感器中生物识别物质的种类可将生物传感器分为酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器等，其中酶传感器是问世最早、最成熟的生物传感器。 35．影响酶反应器性能的因素很多，一般可以从以下几个方面考虑：固定化酶的形状，底物的物理性质，酶的稳定性及酶反应动力学特性等。 39．造成固定化酶活性的损失可能有下列原因：(1)酶本身的失活：(2)酶从载体上脱落；(3)载体的破碎或溶解。 42．突变酶的应用：提高酶活性及稳定性；研究酶的功能基团。 48．交联酶晶体的生成通常分为两步：(1)酶晶体的形成；(2)使用双或多功能基团试剂如戊二醛将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分，进行共价交联，保持酶的活性、酶晶格不被破坏。 58．氨基酰化酶是世界上第一种工业化生产的固定化酶。氨基酰化酶的立体特异性是L-型，可对化学合成的乙酰-DL-氨基酸拆分，从而得到纯L-氨基酸。 第七章 发酵工程制药 3．生物催化剂通常是细菌、放线菌、真菌或其解体产物(如酶)和动植物细胞等。 6．我国酶制剂主要是α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等。 8．抗生素是最大一类由发酵生产的微生物次级代谢产物，具有广泛的抗菌作用和抗癌、抗病毒、抗虫等生物活性，已成为发酵工业的最重要组成部分。 19．绝大多数放线菌都是革兰阳性菌，除少数外，它们都是好氧的，生长的最适温度是28～30℃，当然嗜热放线菌例外。 30．发酵对无菌空气的要求是：无菌、无灰尘、无杂质、无水、无油、正压等几项指标。 34．在药物发酵生产中常用的碳源有糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物等。 43．上游工程包括优良菌种的选育、最适发酵条件(培养基的组成、pH、温度和溶氧等)的优化等。 45．下游工程是指发酵液中产品的分离纯化与鉴定，副产物的回收，废物处理等。 48．每批发酵的全过程包括空罐灭菌、培养基的灭菌、接种、发酵、放罐和洗罐等，所用的时间总和为一个发酵周期。 53．发酵液中产物的积累通常以发酵单位表示。 59．乳糖是青霉素合成的最好碳源。 63．补料最大的量为使放罐时发酵液体积达到罐有效体积的80％~90％。 89．青霉素属β-内酰胺类抗生素，其主要作用机制是干扰细菌细胞壁的合成。 93．多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。 第八章 微生物转化 11．甾体微生物转化反应主要类型有羟化反应、氧化反应、脱氢反应、甾体边链降解等。 第九章 蛋白质药物的化学修饰 1．1990年第一个化学修饰蛋白质药物——PEG修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)上市。 4．从大的方面讲，修饰策略分为随机修饰和定点修饰两种。 10．G修饰后蛋白质的生物活性、免疫原性、稳定性和生物半衰期与PEG．的Mr大小和修饰类型有关。一般PEG的Mr越大，修饰蛋白的活性损失越大、免疫原性越低、稳定性越高、生物半衰期越长，因此Mr选择要综合考虑修饰蛋白的生物活性、免疫原性、稳定性和生物半衰期等多方面的因素。 13． 选择PEG修饰剂要考虑的因素有PEG的Mr、修饰位点、水解稳定性和反应活性、还需要考虑需要的修饰度、修饰剂与蛋白质的连接键的稳定性、修饰后蛋白质的构象变化及修饰后的分离纯化等。 第十章 新型生物技术制药 6．反义核酸药物福米韦生经过美国FDA批