聯用分析技術在農業領域的應用

DNA甲基化檢測 在人類基因組中，3%～6%的胞嘧啶都會在DNA甲基化轉移酶的作用下與甲基基團結合並在CpG二苷酸的5位碳上形成共價鍵。CpG二苷酸在人類基因組中常以大小爲300～3000bp的密集形式存在（CpG島），而這些CpG島通常位於基因的轉錄起始位置附近，具有調控基因表達的功能。CpG島的異常甲基化水平升高會抑制相關基因的表達，造成該基因所代表的蛋白質水平急劇下降。 近年來，DNA甲基化在腫瘤研究領域受到了極大關注，特別是CpG島高甲基化所導致的抑癌基因轉錄失活及異常低甲基化所致原癌基因的激活已成爲腫瘤研究中的熱點問題，除此之外DNA甲基化還與印記缺陷、精神分裂症、抑鬱狂躁型憂鬱症等複雜疾病有一定相關性。 目前常見的甲基化檢測方法主要有測序、甲基化特異性PCR、熒光定量PCR等。相比之下，質譜DNA甲基化檢測，在引物設計、檢測成本及數據分析等方面更加便捷、快速和準確。 其主要檢測步驟可分爲4個部分： 第一步是通過亞硫酸氫鹽反應對基因組DNA進行處理，目的是將序列中未甲基化的C轉化爲U，而甲基化的C保持不變。 第二步是利用5'末端帶有T7啓動子序列的引物對目標CpG島區域進行PCR擴增，並在擴增後加入蝦鹼性磷酸酶處理殘餘dNTP。 隨後，利用RNA轉錄酶對擴增產物進行轉錄並在第四步對轉錄產物進行尿嘧啶特異性酶切處理。 上述步驟完成後，樣品中未甲基化的C最終變爲A，而甲基化的C最終變爲G，然後質譜可根據G和A之間16Da的分子量差異檢測出甲基化和未甲基化的C並通過各自的峯面積計算該CpG位點甲基化比例，並估算整個檢測片段內的平均甲基化水平。 質譜平臺靈敏度高，可檢測低至5%的甲基化水平，特異性良好。